煙酰胺單核苷酸(NMN)改善肺泡上皮細胞衰老

已更新：2月28日

煙酰胺單核苷酸(NMN)改善肺泡上皮細胞衰老

【摘要】肺泡上皮細胞（ACEs）隨著年齡的增長而逐漸衰老，這是呼吸防禦和功能下降的主要原因之一。研究 ACE 衰老的機制對於了解人類呼吸系統的工作原理非常重要。據報導，NAD+ 在老化過程中會減少。補充NAD+中間體可以激活去乙酰化酶（SIRT1-SIRT7），調節運動和飲食限制的益處，降低細胞內氧化應激水平，改善線粒體功能，從而逆轉細胞衰老。我們發現，煙酰胺單核苷酸 (NMN) 可以有效緩解 8-10 個月大的 C57BL/6 小鼠肺部與年齡相關的生理衰退和博來黴素誘導的 6-8 週幼齡小鼠肺纖維化。此外，用 NMN 治療原發性 ACE 可以顯著改善體外細胞衰老表型。這些發現對改善老年人呼吸系統功能、降低呼吸系統疾病的發病率和死亡率具有重要意義。

1. 簡介

隨著年齡的增長，肺最顯著的變化之一是肺泡上皮細胞 (ACE) 的數量和功能下降。ACE主要位於呼吸道末端，是血氣屏障的主要成分。它們分為I型肺泡上皮細胞（AECIs）和II型肺泡上皮細胞（AECIIs）。 AECI 佔 AEC 總數的 96%，而 AECII 僅佔 4%。有趣的是，肺中的 AECII 是活躍的祖細胞和分泌細胞，分泌肺泡表面活性劑，並維持肺泡表面張力。 AECs 佔肺表面積的 99%，在肺功能中起主要作用：屏障、氣體交換和免疫調節。這些細胞的衰老是衰老過程中肺功能下降的主要原因。雖然 AECs 的衰老對於衰老相關慢性肺病的研究具有重要意義，但其具體機制和作用仍不完全清楚。據報導，補充 NAD+ 可改善許多與衰老相關的疾病，例如神經退行性疾病。然而，NAD+ 前體對肺老化和 AEC 衰老的影響尚未見報導。

最近的研究發現，補充 NAD+ 前體煙酰胺單核苷酸 (NMN) 和煙酰胺核苷 (NR) 可以增加細胞內 NAD+ 的水平。 10 , 13 在體外培養的AECs中補充NMN可以顯著緩解AECs的複制衰老，防止與年齡相關的生理衰退，增加DNA修復功能，改善線粒體功能障礙和葡萄糖耐受不良。在體內添加 NAD+ 前體是否能在體外緩解肺衰老和改善 ACEs 衰老仍不清楚。

2. 結果

2.1。 NMN緩解老年小鼠肺泡細胞衰老

身體各種組織和器官的功能隨著年齡的增長而下降，伴隨著細胞內NAD+的減少，包括肺。然而，NAD+的減少是否介導肺泡細胞的衰老以及補充NMN是否可以緩解這種表型尚未見報導。我們以 500 mg/kg/天的劑量對 8-10 個月大的 C57/BL6 小鼠施用 NMN，持續 2 個月。之後，檢測肺組織的老化指標。衰老細胞伴隨著增殖能力的降低，主要是由於細胞週期抑制蛋白的表達增加。我們發現，與老化組相比，老化+NMN 組與老化組相比，老化+NMN 組和飲用水老化+NMN 組老化相關的循環抑制蛋白顯著降低（圖1）。因此，我們相信長期添加 NMN 可以有效改善肺老化。

(圖一)補充 NMN 的小鼠肺組織中與年齡相關的蛋白質顯著減少。

(A) 飲水(DW)對四組(青年對照組、老年對照組、老年和NMN組)小鼠石蠟切片進行P16、P21(bar = 20 μm)免疫組化染色，老年和 NMN 組通過管飼法（G），每組 10 隻小鼠）。

(B)隨機取小鼠肺組織衰老相關蛋白P16染色5個視野進行統計分析。

2.2. NMN可以緩解ACE的複制衰老

在動物實驗的基礎上，我們想進一步探索 NMN 是否可以直接緩解 ACE 複製性衰老和應激誘導的衰老。為了證實這一假設，我們分離了初級 ACE。細胞傳至第7/8代時出現衰老表型。細胞大小呈圓形，形態明顯變大，細胞增殖受到抑制。細胞衰老的原因之一是NAD+降低、氧化/抗氧化系統失衡以及氧化應激增加引起的應激誘導衰老。 NMN，NAD+的前體，能有效提高體內NAD+的水平。 14 我們發現補充 NMN 可以有效緩解 ACE 的衰老。從第 4 代到第 7 代 (P7) 將 NMN 添加到細胞中。且細胞衰老表型較對照組明顯改善(P3)。在第 7 代/第 8 代的 ACE 中，衰老相關的 SA-β-gal 染色顯著降低（圖 2A 和 C）。總之，添加 NMN 可以有效緩解肺原發性 ACE 的複制。

(圖二)NMN 改善了細胞衰老。

(A) NMN 減輕肺泡上皮細胞衰老，如倒置顯微鏡下 SA-β-gal 染色所示（比例尺 = 20 μm）；每組設置三組多孔。

(B) NMN 減輕博萊黴素誘導的肺泡上皮細胞衰老，如倒置顯微鏡下的 SA-β-gal 染色所示（比例尺 = 500 μm）。

2.3. NMN減輕博萊黴素誘導的小鼠肺泡細胞衰老

NMN可以緩解隨著衰老的肺泡細胞的複制性衰老。它是否可以緩解壓力引起的肺泡老化需要進一步研究。博來黴素（BLM）是糖肽類抗生素家族的成員，具有有效的抗腫瘤活性。其主要毒副作用是肺纖維化，其機制是基因組不穩定和產生活性氧。 23 BLM 誘導的肺纖維化是基於 ACE 衰老的誘導，從而破壞 ACE 的再生。 24 研究發現，BLM 通過誘導細胞凋亡來誘導伴隨肺纖維化的細胞衰老。因此，我們利用 BLM 誘導肺原發性上皮細胞衰老，試圖檢測 NMN 是否可以緩解 ACE 的衰老。已經發現，在治療的第 21 天，BLM 的劑量為 2 mg/kg。

因此，我們通過咳嗽法給予小鼠 BLM，並開始以 500 mg/kg/天的劑量進行 NMN 灌胃。灌胃21天后，檢測到衰老相關指標。結果發現，NMN組肺外觀明顯改善，肺重量明顯下降（圖3A和B）。通過對小鼠肺組織的HE染色，我們發現NMN可以減輕BLM引起的肺泡破壞和間質炎症浸潤（圖3C）。此外，我們對肺組織和肺泡灌洗液進行了流式細胞術，發現添加 NMN 組的炎症細胞明顯減少（圖 4）。免疫組化染色顯示，在補充 NMN 的組中，衰老相關循環抑制蛋白的表達顯著降低（圖 3C-E）。因此，我們認為添加 NMN 可以顯著改善 BLM 誘導的 ACE 衰老。

(圖三)NMN 改善了肺的外觀和重量。

(A) 小鼠肺組織解剖的外觀。

(B) 小鼠肺組織的 HE 染色 (比例尺 = 100 μm) 和 P16 (比例尺 = 20 μm)、P21 (比例尺 = 20 μm) 免疫組織化學染色對用博來黴素處理的小鼠的石蠟肺切片進行。

(D)隨機取5個P16免疫組化染色視野進行統計分析。

(E) 隨機取5個P21免疫組化染色視野進行統計分析(**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)

(圖四)NMN 改善了肺部炎症。

(A)NMN 減輕了博萊黴素引起的小鼠肺部炎症。流式細胞儀檢測肺組織中巨噬細胞、中性粒細胞和單核細胞的浸潤情況。

(B)流式細胞儀用於檢測肺泡灌洗液中的巨噬細胞，每組三隻小鼠。巨噬細胞活化可分為經典活化的M1巨噬細胞（經典活化巨噬細胞）和選擇性活化的M2巨噬細胞（交替活化巨噬細胞）。

(C)流式細胞儀檢測肺組織巨噬細胞，每組3隻小鼠。 AM是肺泡巨噬細胞，在肺損傷的發病過程中起示範作用。 BLM模型組小鼠肺泡巨噬細胞受損，百分比降低。 NMN給藥後，損傷明顯改善，導致其百分比恢復。 M1 型巨噬細胞通常被干擾素-γ 和細菌脂多醣 (LPS) 激活。 M1主要分泌促炎因子，在炎症早期發揮重要作用。 M2 型巨噬細胞被 Th-2 細胞因子（如 IL-4、IL-13 和免疫複合物）激活。 M2表達抑制炎症因子，在抑制炎症和組織修復中發揮作用。

(D)流式細胞儀檢測肺泡灌洗液中的巨噬細胞，每組3隻小鼠。

(E)流式細胞儀檢測肺組織中的中性粒細胞，每組3隻小鼠。

(F)流式細胞儀檢測肺組織中的單核細胞，每組3隻小鼠。

(G)流式細胞儀檢測肺泡灌洗液中的中性粒細胞，每組3隻大鼠。

(H)流式細胞儀檢測肺泡灌洗液中的單核細胞，每組3隻小鼠。 (****p < 0.0001)

2.4. NMN 減輕 BLM 誘導的 ACE 衰老

同樣，基於 BLM 誘導肺泡細胞衰老的體內模型，我們檢測了 NMN 是否可以有效緩解 ACE 的衰老。我們發現 NMN 可以有效緩解 BLM 誘導的衰老。 BLM的劑量為5μg/ml。誘導時間是 3 天，然後是 3 天后。 BLM 處理的細胞同時添加了 NMN (500 μm/ml)。 BLM 誘導的 ACE 中 SA-β-gal 的活性在 NMN 添加組中顯著低於未添加組（圖 2B 和 D）。總之，添加 NMN 可以有效緩解 BLM 誘導的肺原代細胞衰老。

3. 討論

我們試圖通過小鼠模型了解 NMN 是否可以緩解人類 ACE 的複制和應激誘導的衰老。我們發現，在體內和體外，相同代數的 ACE 在 NMN 補充組和未補充組中顯著減少。 BLM 處理和添加 NMN 的 BLM 處理都沒有改變減少的細胞數量，衰老的 ACE 也顯著減少。我們還發現 NMN 減少了 BLM 引起的小鼠肺部炎症。我們的數據表明，NMN 可以有效緩解體內和體外 ACE 的複制和應激誘導的衰老。它為未來與衰老相關的慢性肺病和外部刺激引起的肺損傷提供了一種預防和治療的方法。

NAD+ 在體內隨著年齡的增長而降低，被認為是年齡依賴性病理過程的重要調節劑。 NAD+ 參與體內的各種生理活動，是糖酵解、三羧酸循環和氧化磷酸化以及細胞內各種氧化還原反應的關鍵輔助因子。NAD+ 補充劑的抗衰老作用已在許多組織和器官中得到證實，例如衛星細胞、血管生成和骨骼肌的心肌。 13 NMN和NR可作為營養添加劑提高體內NAD+水平，從而防止衰老的發生（圖5）。

(圖五)NMN 的途徑補充對抗細胞衰老。

補充 NMN 或 NR 可增加 NAD+ 合成，增強 Sirt1 活性，維持線粒體功能，保護核 DNA 完整性，抗炎，促進細胞抗氧化功能，從而抵抗複製和壓力誘導的衰老

導致細胞衰老的因素很多，包括氧化應激、線粒體功能障礙等。研究表明，BLM 在細胞中的毒性主要是由於遺傳不穩定性和氧化應激增加所致。補充 NMN 不僅可以降低細胞中的氧化應激水平，還可以減少氧化應激引起的細胞功能損害，包括遺傳不穩定性，改善線粒體功能，並增加 NAD+ 依賴性酶（例如 SIRT 家族）的活性. 衰老是一個複雜的過程；我們還沒有深入研究 NMN 如何防止 ACE 老化。細胞衰老是一個複雜的過程，伴隨著基因表達和細胞因子和蛋白酶 (SASP) 分泌的變化 ;但是，我們在這個實驗中沒有進行 SASP 測試。目前的研究表明，衰老的 ACE 具有高水平的促炎細胞因子表型。然而，本研究未檢測到這種與年齡相關的表型。雖然我們的數據沒有排除其他肺實質細胞或肺外因素，也沒有區分肺泡 I 型和 II 型細胞。然而，我們的研究是基於肺中的細胞，因此毫無疑問，在肺泡細胞中添加 NMN 絕對可以減少衰老細胞。

總之，我們發現長期添加 NMN 可以在體內和體外有效地改善 ACE 複製和應激誘導的衰老。 NMN的膳食補充可能是未來預防和減少與衰老相關的肺病和應激性肺損傷的一種新的有效方法。